Geboren in Saint-Malo, einer ummauerten Seefahrerstadt in der Bretagne, die mit Atlantikfischerei und Handel verbunden war. Das Aufwachsen unter Lotsen und Schiffseignern prägte seine Seemannschaft sowie seine Vertrautheit mit Gezeiten, Küstennavigation und langen Fahrten.

Als Jugendlicher lernte er bei Seeleuten aus Saint-Malo, die nach Iberien und in den Nordatlantik segelten. Er erwarb praktische Navigationskenntnisse, Schiffsdisziplin und Erfahrung im Umgang mit Ladung, die später königliche Expeditionen durch unbekannte Gewässer trugen.

Schon in jungen Erwachsenenjahren galt er als fähiger Lotse, gewohnt an gefährliche Küstenanläufe und Hochseepassagen. Sein wachsender Ruf in der Seefahrergemeinschaft von Saint-Malo machte ihn zu einer naheliegenden Wahl für den königlichen Dienst.

König Franz I. unterstützte eine Fahrt, um neue Handelsrouten und eine mögliche Passage nach Asien zu finden, inmitten der Rivalität mit Spanien und Portugal. Cartier erhielt durch Gunst am Hof und die Netzwerke der Reeder aus Saint-Malo das Kommando und die nötigen Mittel.

Von Saint-Malo aus segelnd erkundete er die Küsten Neufundlands und fuhr in den Golf des Sankt-Lorenz-Stroms ein, wobei er Buchten und Landspitzen kartierte. Er sammelte Erkenntnisse über Fischgründe, Geografie und lokale Gemeinschaften und berichtete darüber in Frankreich.

In Gaspé errichtete er ein großes Kreuz mit königlichen Symbolen und signalisierte damit einen französischen Anspruch auf die Region. Zudem brachte er Donnaconas Söhne Domagaya und Taignoagny nach Frankreich, eine Zwangsmaßnahme, die spätere Diplomatie und Misstrauen prägte.

Mit erweiterter königlicher Unterstützung brach er mit Schiffen, darunter die Grande Hermine, auf, um über den Golf hinaus ins Landesinnere vorzudringen. Ziel der Expedition war es, Reichtümer und einen Westdurchgang zu finden und zugleich Frankreichs strategische Position in Nordamerika zu stärken.

Gestützt auf Küstenwissen und Informationen indigener Quellen segelte er flussaufwärts zur iroquoiischen Siedlung Stadacona. Nahe dem heutigen Québec ankerte er und begann ein angespanntes Zusammenleben mit Donnaconas Gemeinschaft.

Weiter flussaufwärts gelangte er nach Hochelaga, wo die Bewohner ihn mit Zeremonie und Neugier empfingen. Er bestieg den nahegelegenen Berg, den er Mont Royal nannte, beobachtete das Flusssystem und stellte sich Wege tiefer in den Kontinent vor.

Eis schloss die Schiffe bei Stadacona ein, und Skorbut tötete und schwächte während des grausamen Winters viele Seeleute. Ein indigenes Heilmittel aus einem Nadelbaumaufguss, später mit annedda in Verbindung gebracht, half den Überlebenden zu genesen, als europäische Medizin versagte.

Als sich im Frühjahr der Fluss öffnete, nahm Cartier Donnacona und mehrere weitere Personen gefangen, um sie am französischen Hof vorzuführen. Die Erzählungen der Gefangenen vom reichen „Königreich Saguenay“ nährten französische Hoffnungen auf Gold und ein nördliches Imperium.

Zurück in Frankreich berichtete er Franz I. und dessen Beratern über den Sankt-Lorenz-Strom, fruchtbare Landschaften und mögliche Ressourcen. Die Mischung aus Karten, Berichten und Gefangenen führte trotz hoher Verluste zu erneuten Investitionen.

Frankreich organisierte ein Kolonisationsunternehmen und ernannte Roberval zum Generalstatthalter, während Cartier Schiffe mit Siedlern und Vorräten vorausführte. Der Auftrag verband Erkundung mit Festungsbau sowie religiös-politischen Zielen in einer Zeit zunehmender Konflikte in Europa.

Cartier gründete die Siedlung Charlesbourg-Royal und baute Verteidigungsanlagen, um einen Brückenkopf am Fluss zu sichern. Die Kolonie litt unter belasteten Beziehungen zu lokalen Gemeinschaften, schwieriger Versorgung und Unsicherheit über Verstärkungen aus Frankreich.

Nach einem zermürbenden Winter, zunehmenden Konflikten und enttäuschenden Aussichten entschied Cartier, nach Frankreich zurückzukehren. Er traf Roberval in Neufundland, segelte jedoch weiter heimwärts und beendete damit seine aktive Führungsrolle in Frankreichs früher Sankt-Lorenz-Kolonisierung.

Proben aus der Nähe von Charlesbourg-Royal wurden in Frankreich als kostbare Mineralien gefeiert und weckten Erwartungen schnellen Reichtums. Später erwiesen sie sich als weitgehend wertlos, woraus die französische Redewendung über „kanadische Diamanten“ entstand und der Bergbaueifer gedämpft wurde.

In späteren Jahren blieb er in Saint-Malo und profitierte vom Ansehen, das er durch königliche Fahrten und Atlantikerfahrung gewonnen hatte. Seine Berichte und Karten beeinflussten weiterhin das französische geografische Wissen, auch als die Kolonisierungsbemühungen vorübergehend stockten.

Er starb in Saint-Malo und hinterließ ein Vermächtnis, das mit der Kartierung und Benennung der Sankt-Lorenz-Region verbunden ist. Seine Reisen legten Grundlagen für Neufrankreich und prägten spätere französische Siedlungen rund um Québec und den Flusskorridor.